Vitenskap

Krystallisering av mine egne forskertårer

Å prokrastinere skikkelig er en kunst, enten må det være nyttig, eller så må det være interessant. Så når jeg sitter her og skal skrive en doktorgradsavhandling sløser jeg ikke bort verdifull tid på å lese tegneserier. Neida, jeg har nå tatt i bruk min egen fagkunnskap (proteinkrystallografi) til å studere mine egne tårer. Kall meg emo, kall meg nerd, men se i det minste på bildene.

Først og fremst, idéen vokste frem gjennom utallige kaffepauser og andre mindre skjerpede kollegasammenkomster. Tårer inneholder nemlig et protein som heter lysozym. Lysozym er alle proteinkrystallografers modellprotein, av den enkle grunn at det er lett å få tak i og lett å lage krystaller av. Lysozym er et bakteriedrepende protein som finnes i store mengder i mange organismer, f. eks i høneeggehvite og i tårer og spytt hos pattedyr.


 Men hva er proteinkrystallografi?

Veldig mange av prosessene i kroppen blir styrt av proteiner. I medisinsk forskning trengs ofte detaljerte bilder av hvordan disse proteinene ser ut, for å for eksempel kunne finne et legemiddel mot en sykdom. Vanligvis når vi vil se på noe smått, kan vi bruke et lysmikroskop, eller til og med et elektronmikroskop. Men proteiner er så små at det er ikke fysisk mulig å få et detaljert bilde med dette. I stedet bruker vi røntgenstråler som ”lyskilde”. Men dette er heller ikke bra nok, så først må vi lage krystaller av proteinene våre. En proteinkrystall består av kun ett protein som er repetert igjen og igjen og ligger i et ordnet gittermønster. Denne repetisjonen gjør at vi får en forsterking av signalet, og ved å bestråle krystallene med røntgenstråler, kan vi få et bilde av hvordan alle atomene inne i proteinet er koblet til hverandre.


Sanking og analyse av forskertårer

tears2For å analysere og krystallisere mitt eget lysozym måtte jeg først produsere nok tårer. Dette ble gjort ved å sitte på kontorpulten og kutte en løk i veldig små biter, noe som resulterte i ca 50 mikroliter tårer (3 dråper) fanget opp i et eppendorfrør. Siden det allerede er kjent at lysozym er et relativt lite protein prøvde jeg å separere det fra andre proteiner i tårer ved å presse det gjennom et filter som skal holde igjen store proteiner (50 kDa konsentrasjonsrør ved sentrifugering, for interesserte). Deretter tok jeg ut noen mikroliter av hver av disse 3 fraksjonene, og kjørte de gjennom en SDS-polyakrylamidgel, som separerer proteiner etter størrelse. Dette for å se hva slags proteiner jeg har i de ulike fraksjonene, og om jeg har klart å rense ut lysozym. Ved å sammenligne min gel med tidligere forskning*, kunne jeg finne ut hvilke proteiner jeg sannsynligvis har i tårene mine, og hvor rent jeg hadde klart å få lysozymet mitt.

Tears_lysozyme

Denaturerende SDS-polyakrylamidgel (tris-glycin). Alle proteiner utenom lysozym har en størrelse på over 50kDa under native forhold.

Krystallisering

Så kom turen til krystallisering av forsker-lysozymet. Krystaller gror ved kontrollert utfelling. Dette vil si at vi må utsette proteinet for akkurat de rette betingelsene for å få det til å klumpe seg sammen i en ordnet krystall. Dette innebærer ofte å øke eller senke pH, i tillegg til å tilsette salter. I dette tilfellet visste jeg at lysozym liker å krystallisere ved pH 4.5 og rundt 60 g/L NaCl. Jeg blandet da 1 mikroliter lysozym med 1 mikroliter krystalliseringsvæske i et lukket system. Dette oppsettet skal i teorien gi meg lysozymkrystaller etter noen dager.

Så hvordan gikk det?

Vel, foreløpig har ingen krystaller blitt dannet, og ved å se på proteingelen kan vi få en idé om hvorfor. Det rensede lysozymet inneholder fremdeles hvertfall 3 andre proteiner i relativt store mengder. Ut fra styrken på båndene ser det ut til å ikke være mer enn ca 50% rent, og til krystallografi foretrekker vi at det hvertfall er 90% rent. I tillegg kan jeg se at konsentrasjonen ikke er særlig høy, kanskje på rundt 2 g/l, når vi egentlig vil ha 10 g/l eller høyere. Planen videre er dermed å rense proteinet enda mer, ved bruk av andre mer effektive metoder.

I mellomtiden kan dere se hvordan det egentlig skulle sett ut. Nedenfor er et bilde av noen andre lysozymkrystaller vi har laget på laben, disse er ca 0.1mm store, og kan fint plasseres inn i en spesiell røntgenmaskin kalt et røntgendiffraktometer. Etter mye dataprosessering og jobb, vil vi til slutt komme fram til en 3D-modell av proteinet inni krystallen, og jeg kan finne ut om lysozymet mitt er likt som andre menneskers.

Lysozym har blitt analysert mange ganger tidligere, så det jeg har gjort her er ikke noe grensesprengende, men litt gøy må man jo ha. Kanskje kan jeg tilslutt lage en print av min egen lysozym-struktur til stueveggen.

lysChuman_cryst

Krystaller av lysozym fra eggehvite, og ferdig løst krystallstruktur av menneskelig lysozym (PDB ID: 1IWZ)

* Proteingel sammenlignet med ligende data fra Sack et al., “Diurnal tear cycle: Evidence for a nocturnal inflammatory constitutive tear fluid” Invest Ophthalmol Vis Sci. 1992, 33 (3): 626-40.

PS. Svært lite statskassepenger har blitt sløst på dette lekeprosjektet, det har blitt gjort utenfor arbeidstid, og med brukt/utgått materiale.

Previous post

Kjappiser: kvinnelige superhelter, brystkreftmedisin og nedgang i vaksinemotstand

Next post

Fakta og følelser

Julie

Julie

Julie er nylig ferdig med doktorgrad i biokjemi, og forsker på kolera. Og svaret på "pest eller kolera?" er faktisk stort sett "kolera". Hun er ofte å se på skeptikere på puben, både for ølen og for å gjenvinne troen på menneskeheten etter for mye lesing av VGs kommentarfelt.

2 Comments

  1. 03.03.2015 at 13:38 —

    Og ville det være så galt om noen statskassepenger gikk til slik nyttig kunnskapsformidling?

  2. 10.03.2015 at 09:50 —

    Haha, nei kanskje ikke. Egentlig burde jeg fått undervisningspoeng for dette :)

Leave a reply